Ông bị hành quyết ngày 8-10-1967 (giờ Tây Bán Cầu) theo chỉ thị của CIA. Theo Felix Rodriguez, một trong các điệp viên CIA ở Bolivia đã phát hiện căn cứ của quân du kích và ra mệnh lệnh tử hình các chiến sĩ cách mạng, thì Che Guevara, lúc đó đã bị thương và áo quần rách nát.[7] Lời nói cuối cùng của ông với Mario Teran, người thực hiện lệnh xử bắn là: "Cứ bắn đi, đồ hèn, cùng lắm chúng mày chỉ giết được một con người thôi."[5]

Để làm cho các vết thương do đạn có vẻ khớp với câu chuyện chính thức công bố, Felix Rodriguez đã lệnh cho người xạ thủ ngắm bắn cẩn thận để các vết thương này trông giống như thể Che đã bị giết trong một cuộc chạm súng với quân đội Bolivia, và như vậy sẽ giúp che giấu vụ ám sát bí mật. Sau đó họ còn chặt đi một bàn tay của Che.[8]

Sau vụ hành hình, hình ảnh ông nằm bất động, đôi mắt vẫn mở to - còn ám ảnh tâm trí hàng triệu người. Trong buổi lễ tưởng niệm ở Rosario, quê hương nơi ông ra đời, linh mục Hernán Benítez đã nói: "Hai phần ba nhân loại bị áp bức bị chấn động vì cái chết của Che. Một phần ba còn lại thuộc về Che hoàn toàn. Che đã đón nhận cái chết với tất cả đặc trưng của những anh hùng thần thoại, những người sống mãi trong lương tâm nhân loại..."[5] Bàn tay này sau đó được gửi cho lãnh đạo Cuba Fidel Castro nhằm uy hiếp ông. Một nhân viên CIA còn cắt một lọn tóc và lấy đi một số kỉ vật của ông (cuối năm 2007, lọn tóc được bán đấu giá hơn 100 ngàn USD, trong khi lọn tóc của cố Tổng thống Mỹ Abraham Lincoln trước đây chỉ đấu giá được 25.000 USD)

Chính quyền Barrientos chôn giấu xác ông, và mãi đến ba mươi năm sau, vào ngày 17 tháng 10 năm 1997, hài cốt ông cùng bảy người khác tại một ngôi mộ tập thể không được đánh dấu mới được khai quật và tìm thấy, mang về Cuba và mai táng tại Santa Clara, nơi ông đã lập chiến công lớn ở đó, quyết định sự thành công của Cách mạng Cuba.

Nguyên nhân dẫn đến sự thất bại của chiến dịch Bolivia chính bởi:

• Tổ chức của Che chưa được nhân dân Bolivia lúc đó tin tưởng ủng hộ; chính quyền Cuba hậu thuẫn triệt để; chưa thực sự liên kết được các cuộc đấu tranh
• Lực lượng yếu, trang bị thô sơ, chưa có chiến lược và sách lược đúng đắn phù hợp, trong khi kẻ thù mạnh - lớn
• Thời cơ chưa chín muồi để cách mạng diễn ra rộng khắp và thành công.

Mặc dù thất bại, tên tuổi và ảnh hưởng của Che mỗi ngày một lan rộng khắp châu Mỹ Latinh và cả thế giới. Ông đã trở thành một biểu tượng của sự đấu tranh, của tình nhân ái, hy sinh thân mình chống lại áp bức và nghèo đói để đem lại sự công bằng cho mọi người.[9] Có người ví ông như Đông Kihôtê (Don Kyjote) chiến đầu vì người bị áp bức. Trong tài liệu được giải mật gần đây gửi Tổng thống Mỹ lúc bấy giờ là Lyndon B. Johnson, cố vấn cao cấp Walt Rostow đã gọi quyết định giết hại Che là "ngu xuẩn". Nhiều nhà nghiên cứu khác cũng thừa nhận sai lầm lớn của Mỹ là đã cho lưu hành bức hình Che Guevara sau khi ông bị giết, nó khiến cho người ta liên tưởng "hình ảnh Chúa Giêsu chịu nạn" vì đức tin của mình.[5]

Học giả phương Tây - Ariel Dorfman đã viết: “Đối với những con người không bao giờ theo bước Che, bị chìm đắm trong thế giới đầy hoài nghi yếm thế, sự tự tư tự lợi và nền công nghiệp tiêu thụ điên cuồng này, còn có gì hấp dẫn hơn thái độ khinh bạc của Che đối với những tiện nghi vật chất và những ham muôn tấm thường. Có thể nói rằng, đó là phẩm chất riêng biệt độc đáo của Che và không thể có bản sao thứ hai của anh trong thế giới này, đây là điều khiến anh trở nên cực kỳ quyến rũ”…